Cat No.XY9RB0024
Rabbit CAM(Calmodulin) ELISA Kit
兔 CAM ELISA試劑盒
尊敬的客戶,感謝你選用本公司的產(chǎn)品。本產(chǎn)品適用于體外定量檢測兔血清、血漿或細胞培養(yǎng)上清液、組織等中天然和重組的CAM濃度。檢測其他特殊樣本請咨詢本公司技術支持。試劑盒僅供科研使用。使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑盒組分。如有疑問,請聯(lián)系及時與我們聯(lián)系。
規(guī)格 | 銷售價 | 市場價 |
96T | 2533 | 2980 |
48T | 1785 | 2100 |
本試劑盒采用雙抗體夾心法,雙抗體夾心原理,是基于要測試的抗原具有二價以上的特性,能識別包被抗體,同時能識別檢測抗體,具體過程如下:
(1)將特異性抗體與固相載體連接,形成固相抗體,洗滌除去未結合的抗體及雜質,并用無關蛋白封閉空余結合位點。
(2)加受檢標本使之與固相抗體接觸反應一段時間,讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合,形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。
(3)加生物素標記抗體,使固相免疫復合物上的抗原與生物素標記抗體結合。洗滌未結合的生物素標記抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。
(4)加辣根過氧化物酶標記親和素,使生物素標記抗體與辣根過氧化物酶標記的親和素結合。洗滌未結合的酶標記物。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。
(5)加入底物顯色,即可計算標本濃度。
(6)注:一個抗體分子上可以標記上若干個生物素分子,一個生物素分子可以結合一個辣根過氧化物酶標記的親和素,從而帶來了大量的辣根過氧化物酶結合到抗體上,比傳統(tǒng)的直接辣根過氧化物酶標記抗體具有更高的敏感性和放大效應。
[兔 CAM酶聯(lián)免疫試劑盒檢測原理]:
本實驗采用雙抗體夾心ELISA法。所提供的ELISA Kit是典型的夾心法酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(ELISA)。預先包被的抗體為抗兔CAM單克隆抗體。檢測相抗體為多克隆抗體,經(jīng)生物素(biotin)標記。樣品和生物素標記抗體先后加入酶標板孔反應后,PBS或TBS洗滌。隨后加入過氧化物酶標記的親和素反應;經(jīng)過PBS或TBS的洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成*終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測因子呈正相關。
[兔CAM酶聯(lián)免疫試劑盒檢測原理示意圖]:
[試劑盒組成]:
Name | 96 Tests | 48 Tests | Storage |
Antibody precoated plate | 8×12 | 8×6 | 4/-20℃ |
Rabbit CAM Standards | 2 vial | 1 vial | 4/-20℃ |
Biotinylated antibody(1:100) | 1vial | 1 vial | 4/-20℃ |
Enzyme conjugate(1:100) | 1vial | 1 vial | 4/-20℃ |
Enzyme diluent | 1vial | 1 vial | 4/-20℃ |
Antibody diluent | 1vial | 1 vial | 4/-20℃ |
Standard diluent | 1vial | 1 vial | 4/-20℃ |
Sample diluent | 1vial | 1 vial | 4/-20℃ |
Washing buffer(1:25) | 1vial | 1 vial | 4/-20℃ |
Colour Reagent A | 1vial | 1 vial | 4/-20℃ |
Colour ReagentB | 1vial | 1 vial | 4/-20℃ |
Colour ReagentC | 1vial | 1 vial | 4/-20℃ |
Instruction | 1 set | 1 set | RT |
[試驗所需自備試驗設備和器材]:
1. 酶標儀(450nm檢測波長濾光片,570nm或630nm校正波長濾光片)。
2. 洗板機(可調注液量,保證每孔350μl洗液而不溢出)。
3. 超凈工作臺,生物安全柜,通風柜。
4. 高精度單道加液器(量程為0.5-10μl,2-20μl,20-200μl,200-1000μl).
5. 高精度多道加液器(8道或12道,量程為50-300μl).
6. 37℃恒溫箱。
7. 低溫離心機。
8. 電冰箱(4℃,-20℃,-86℃).
9. 分析天平。
10. 剪刀,鑷子,鉗子等。
11. 漩渦混合儀,低頻振蕩器等。
[試驗所需自備試驗耗材及試劑]:
1. 離心管(容量為1.5ml,5ml等)。
2. 一次性吸頭(量程為0.5-10μl,2-20μl,20-200μl,200-1000μl).
3. 純凈水或蒸餾水。
4. 坐標紙。
5. 吸水紙。
6. EDTA,枸櫞酸鈉,肝素
[標本收集注意事項]:
1. 收集血液的試管應為一次性的無熱原,無內毒素試管。
2. 血清和血漿避免使用溶血,高血脂標本。
3. 標本應清澈透明,懸浮物應離心去除。
4. 標本收集后若不及時檢測,需按一次使用量分裝,凍存于-20℃,-80℃電冰箱內,避免反復凍融。
5. 可根據(jù)標本的實際情況,做適當倍數(shù)稀釋(建議做預實驗,以確定稀釋倍數(shù))。
6. 收集標本,盡量做到雙份的用量,避免一次實驗失敗,重復實驗時標本缺失,從而耽誤實驗進程。
7. 收集標本時,應該做好防護措施(比如戴手套,口罩,護目鏡等),認為所有標本都具有一定的潛在危險性。
8. 樣本處理應該在生物安全柜里面,并且正確使用生物安全柜。
[標本處理辦法]:
1. 血清:將采集的全血靜置冰箱4℃過夜,然后1000-3000rpm離心10分鐘,取上清立即測試,暫時不測可以放入-20℃(1-3個月)或-80℃(3-6個月)保存。
2. 血漿:用EDTA,枸櫞酸鈉,肝素等作為抗凝劑,加入血液混勻后,1000-3000rpm離心10分鐘,取上清立即測試,暫時不測可以放入-20℃(1-3個月)或-80℃(3-6個月)保存。
3. 組織勻漿:切取組織塊,0.01MPBS中過洗一次;按照1G組織加入5-10ml組織蛋白萃取試劑的比例,在冰水中勻漿。勻漿完成后,5000-10000rpm離心10分鐘,取上清立即測試,暫時不測可以放入-20℃(1-3個月)或-80℃(3-6個月)保存。
4. 細胞培養(yǎng)上清:1000-3000rpm離心10分鐘,取上清立即測試,暫時不測可以放入-20℃(1-3個月)或-80℃(3-6個月)保存。
5. 尿液,腹水,腦脊液等:1000-3000rpm離心10分鐘,取上清立即測試,暫時不測可以放入-20℃(1-3個月)或-80℃3-6個月)保存。
注:樣品稀釋的一般原則
用戶須查閱相關文獻了解標本內待測因子的含量,決定適當?shù)南♂尡稊?shù),以使稀釋后樣品中待測因子的濃度處于ELISA試劑盒的*佳檢測范圍。樣品的稀釋應有詳細記錄。
[注意事項]:
1.試劑盒使用前請保存在2-8℃。除復溶后的標準品,其他成分不可凍結。
2.濃縮生物素化兔CAM抗體,濃縮酶結合物體積小,運輸中顛簸和可能的倒置,會使液體沾到管壁或瓶蓋。因此使用前請用手甩幾下或1000rpm離心1分鐘,以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。
3.濃洗滌液可能會有結晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,使結晶完全溶解后再配制洗滌液。
4.測試過程中,兔CAM凍干標準品為一次性使用,不得分裝。因其濃度較低,溶解兩小時候后,會迅速失活。
5.操作嚴格按照說明書進行,本試劑不同批號組分不得混用。
6.配制試劑時,要用旋渦混合儀混勻。加入孔內的試劑,充分混勻對測試結果尤為重要,使用微量振蕩器(使用頻率),如無微量振蕩器,可在反應前手工輕輕晃動酶標板1分鐘,例如做圓周動作,使加入孔中的反應液混勻。
7.實驗用酶標儀應嚴格按使用說明書規(guī)范操作,并在使用前充分預熱。
8.酶免試驗中兔CAM標準品和樣本檢測時建議作復孔。
9.將不用的微孔板放進原鋁箔袋中,置2-8℃保存。
10.顯色液對光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。
11.超過使用日期的試劑盒不能應用于實驗中。
12.試驗結果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準,使用雙波長檢測時,波長應該設置為450nm和630nm.
13.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應按生物廢棄物處理。終止液為2M硫酸,使用時必須注意安全。
14.各步驟加樣均應使用加樣器,并經(jīng)常校準其準確性,以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內,如標本數(shù)量多,使用排槍加樣。
15.每次試驗測定的同時做標準曲線,做復孔。如標本中待測物質含量過高(樣本OD值大于標準品孔濃度的OD值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n倍)后再測定,計算時請乘以總稀釋倍數(shù)(×n)。
16.不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。
17.以洗板機洗板時,每孔注液量不應少于350μl,注意檢查加樣頭是否堵塞。手工洗板時,用帶紙屑的吸水材料應慎重,防止外源性過氧化物酶類似物或氧化還原物與顯色劑發(fā)生反應。
18.用終止液終止反應后,請于10分鐘內讀取OD值。
19.進行復孔實驗時,結果計算一定要求平均值。
20.標本溶血可能會有假陽性結果,因此溶血標本不宜進行此項檢測。
21.試驗時,應該將加過樣品的板條放于密閉盒內,并保持濕度約60%左右。
22.為保證恒溫箱內的溫度為37℃,恒溫箱的溫度要經(jīng)常校準。以確保實驗溫度保持恒定。
23.48T的試劑盒,所有組分均為96T的50%的量。
[檢測前準備工作]:
1.請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒,平衡至室溫后方可進行試驗。
2.將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回。
3.兔 CAM標準品:加入標準品稀釋液1.0ml至凍干兔 CAM標準品中,靜置10分鐘,待其充分溶解后,輕輕混勻(濃度為5000 pg/ml),之后在管身標注①,然后根據(jù)需要進行稀釋。(建議標準曲線使用以下濃度:5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.13 pg/ml)。注意:務必要保證凍干標準品溶解和混勻。
4.標準品稀釋方法圖例:取7支潔凈的試劑管,分別標注②,③,④,⑤,⑥,⑦,⑧.每管加入300μl標準品稀釋液。從第①管內取出300μl加入到第②管,混勻后,再從第②管取出300μl加入到第③管,以此類推至第⑦管。第⑧管為標準品稀釋液,作為陰性對照使用。
注:復溶標準品原液(5000 pg/ml)請廢棄,不可重復使用。
5.生物素化兔CAM抗體工作液:按當次試驗所需用量,用抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100),配置成生物素化抗體工作液。使用前30分鐘準備。僅供當日使用。
6.酶結合物工作液:按當次試驗所需要用量,用酶結合物稀釋液稀釋濃縮酶結合物(1:100),配置成酶結合物工作液。使用前30分鐘準備。僅供當日使用。
7.TMB顯色工作液:在使用之前30分鐘,按TMB顯色液A 9份加TMB顯色液B 1份(9:1)的比例配制TMB顯色工作液。
[洗滌方法]:
1.自動洗板機:要求注入的洗滌液為350靗,注入與吸出間隔20-30秒。確保機器運用熟練后,再投入實驗中使用。
2.手工洗板:每孔加洗滌液350靗,靜置30秒后甩盡孔內液體,在吸水紙上拍干。手工洗板時,注意加入洗液的過程中,不要造成孔間污染,從而出現(xiàn)跳孔的現(xiàn)象。
[操作步驟]:
1. 從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條,未用的板條和干燥劑請放回鋁箔袋內封存于2-8℃。
2. 預留空白孔(若使用雙波長讀板,空白孔可以不設)。
3. 分別將標本或不同濃度兔CAM標準品(0pg/ml孔加標準品稀釋液)加入相應孔中(100靗/孔),37℃孵箱孵育90分鐘。
4. 提前30分鐘制備生物素化兔CAM抗體工作液。
5. 洗板2次。
6. 加入生物素化兔CAM抗體工作液(100靗/孔)。37℃孵箱孵育60分鐘。
7. 提前30分鐘制備酶結合物工作液。室溫避光放置。
8. 洗板3次。
9. 除空白孔外,加入酶結合物工作液(100μl/孔)。37℃孵箱,避光孵育30分鐘。
10. 洗板5次。
11. 加入TMB顯色工作液(包括空白孔)100μl/孔,37℃孵箱,避光孵育,當標準曲線高濃度的顏色較深,有明顯的顏色梯度的時候,即可終止。試驗顯色反應請勿超過30分鐘。
12. 加入終止液(包括空白孔)100μl/孔,混勻后即刻測量OD(450nm)值(10分鐘內)。
[操作程序總結]:
[結果判斷]:
1.每個標準品和標本的OD值應減去零孔的OD值。(若不減零孔值,標準曲線的零孔應相交于Y軸)
2.手工繪制標準曲線。以標準品濃度作橫坐標,OD值作縱坐標,以平滑線連接各標準品的坐標點。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析,如curve expert 1.3進行結果計算。
3.若標本OD值高于標準曲線上限,應適當稀釋后重測,計算濃度時應乘以稀釋倍數(shù)。
[參考曲線]:
注意:本圖僅供參考,應以同次試驗標準品所繪標準曲線來計算標本含量。
試劑盒參數(shù):
[檢測范圍]:78.125-5000pg/ml
[靈敏度]:Zui小可測兔 CAM達46.875pg/ml
[特異性]:系統(tǒng)和其它因子無交叉反應。
[批間差]:≤12%.
[批內差]:≤8%.
[回收率]:70-110%.
[保存]:-20℃ [短期內(如兩周)可4℃]
[用途]:用于體外定量分析液體標本(通用型)。
[規(guī)格]:96T/48T
[生產(chǎn)日期]:見酶標板鋁箔袋封口鋼印。
[保質期]:12個月(-20℃)
[ELISA常見問題及解決方案]:
問題 | 可能的原因 | 解決方法 |
陰性質控值偏高 | 試劑或者耗材污染 | 更換試劑,使用一次性耗材 |
洗板不充分 | 更換更強配方的洗滌液,增加洗板次數(shù),延長洗板時間 | |
抗體量使用量過高 | 適當減少抗體使用量 | |
整板出現(xiàn)高背景 (陽性值) | 二抗產(chǎn)生了非特異性吸附 | 減少二抗使用量,縮短二抗反應時間 |
顯色液變質 | 更換顯色液 | |
顯色反應時間過長 | 控制顯色反應時間,及時終止反應 | |
試劑或者耗材污染 | 更換試劑,使用一次性耗材 | |
封閉條件不佳導致的非特異性吸附 | 更換封閉能力更強的封閉液,延長封閉時間 | |
反應信號偏低 | 包被條件不合適 | 提高包板濃度,延長包板時間,更換包被緩沖液 |
抗原抗體反應不夠充分 | 延長孵育時間,確保反應在*適溫度下進行 | |
顯色液配方不恰當 | 增加顯色底物的量 | |
二抗結合效果不佳 | 提高二抗?jié)舛,延長反應時間,更換效果更好的二抗 | |
梯度稀釋時產(chǎn)生跳孔現(xiàn)象 | 酶標板疊放導致傳熱不均勻,各孔反應溫度有差異 | 盡量避免酶標板疊放在一起 |
移液器稀釋時未能保持連續(xù)性 | 定期校準移液器,確保移液器的正確使用 | |
反應溶液蒸發(fā) | 酶標板用封條密封或者加蓋 | |
洗板不均勻 | 確定洗板機能夠正常工作 | |
酶標板底有雜物或者水珠 | 讀板時清理干凈酶標板底部 |
特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗,嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途!以實際收貨產(chǎn)品說明書為準,網(wǎng)站說明書僅供參考!
關鍵詞:Rabbit CAM試劑盒 Calmodulin試劑盒 兔CAM(鈣調素)ELISA試劑盒